外泌体成为胰腺癌液态活检早期指标 | 经典再读
前言：又到周四了，一周又快过去了，本周的压轴好戏来啦~搬好小板凳，或者葛优躺的姿势先摆好，这次的干货需要大家细细品味，不是烧脑，是真的要边看边思考哦~首先给新来的小伙伴提个醒，对外泌体体不熟悉的可以先去看看我们之前的 一个小泡泡的大明星之路和你不知道的外泌体专题（1~4），这样读起来就会比较顺畅咯~下面一起来来看看这篇Nature上的文章说了啥↓↓↓
外泌体是脂质双分子层密闭的细胞外囊泡，包含蛋白质和核酸物质。外泌体能由任何细胞分泌，并在血液中循环。循环体液中特定癌症细胞来源的外泌体特异性检测和分离尚属空白。通过质谱分析，作者发现了一个细胞表面糖蛋白glypican-1(GPC1)，在癌症细胞来源的外泌体的特异性富集。利用流式细胞技术检测和分离癌症病人和小鼠血清中的 GPC1+ 循环外泌体(crExos)。腺癌患者的血清中检测到的 GPC1+ crExos具有绝对的特异性和敏感性，能将健康个体、良性胰腺疾病患者和早期及晚期的胰腺癌患者区分开来。GPC1+ crExos 的水平与肿瘤负荷和病人手术前、手术后的生存率相关。产生GPC1+ crExos 的胰腺癌病人和小鼠携带特异的KRAS突变，并在小鼠中检测到胰腺内上皮细胞损伤，尽管核磁共振成像检测为阴性信号。GPC1+crExos 可作为发现早期胰腺癌潜在的非侵入性诊断和筛查工具，为早期胰腺癌的手术治疗提供便利。
1. 外泌体可由任何的细胞分泌并在血液系统中循环。但是肿瘤细胞来源的外泌体在循环体液中尚没有特异性的检测，缺乏相应研究。
2. 早期胰腺癌在临床上很难发现，术后生存率低。来源于肿瘤的外泌体中的成分，是否可以作为胰腺癌早期的诊断生物标识，这是值得探究的问题。
1. 采用蛋白质质谱的方法分析多种癌细胞来源的外泌体和非肿瘤细胞外泌体蛋白质组成差异，分析癌症细胞特有富集的外泌体蛋白成分。
2. 结合临床数据寻找癌症细胞来源外泌体特有的富集蛋白成分及含量和术后的关系。
1外泌体包含多种蛋白成分，不同来源的外泌体成分不同，肿瘤来源的外泌体是否具有特定蛋白成分，能作为肿瘤外泌体的标志？
图 1：使用超速离心的方法提取肿瘤细胞MDA-MB-231、纤维母细胞HDF与NIH/3T3、非肿瘤细胞MCF10A、E10的细胞外囊泡，免疫印迹法检测CD9，CD81外泌体的标记，确认提取的细胞外囊泡为外泌体。用高效液相色谱-质谱联用仪分析了外泌体的蛋白质组成，各细胞蛋白质种数分别为HDF:261, NIH/3T3:171, E10: 232, MCF10A: 214 , MDA-MB-231: 242。生物信息学分析表明48种蛋白质(细胞质25种，细胞核7种、跨膜蛋白5种，膜锚定蛋白1 种及 7 种分泌蛋白) 在癌症外泌体中特有。GPC1在乳腺癌和胰腺癌组织中高表达，在癌症外泌体中特异存在，通过流式细胞技术发现 GPC1 在癌症外泌体中独有。以上数据说明 GPC1 是特异性的肿瘤外泌体的标志。
2上一步已证明 GPC1+是肿瘤外泌体标志，那么这种类型的外泌体在肿瘤患者中的含量怎么样，是不是和非肿瘤患者有区别？能否成为肿瘤患者的生物标志物？
图2：作者分离 32位乳腺癌、190 位胰腺导管癌（PDAC）病人、100 个正常人的循环外泌体。来源于肿瘤血清的外泌体浓度大大高于正常人的外泌体浓度。来源于胰腺导管癌病人的外泌体大小小于其他两种来源的外泌体。GPC1+ crExos 在正常人中阳性率为 0.3 ~ 4.7%（平均 2.3%），75%的乳腺癌病人中GPC1+crExos 高于正常人，190位胰腺癌病人中GPC1+crExos均高于正常人。以上证据证明癌症特别是胰腺癌和GPC1+crExos具有强烈的相关性。
3通过以上实验发现GPC1+ crExos 在癌症特别是胰腺癌中含量增高，能作为肿瘤标志物的现象。研究者自然会问GPC1+ crExos有什么特殊性，能成为肿瘤标志物的原因是什么？
图3： GPC1+ crExos 与胰腺癌的相关性最高，所以作者选了胰腺癌患者为进一步研究对象。KRAS是胰腺癌中的高频突变基因，该基因是否和GPC1+ crExos有关系？作者通过分离 47 个胰腺癌病人的外泌体，比较 GPC1+ 和 GPC1- 外泌体中 KRAS 基因突变的情况。采用q-PCR 发现突变的 KRAS 只在 GPC1+外泌体中出现，而非突变的 KRAS RNA 在两种外泌体中都存在。以上发现部分解释了为什么高GPC1+ crExos和胰腺癌相关联。
4GPC1+crExos 在胰腺癌中的临床应用是否能检测早期胰腺癌，应用价值如何？能否区分胰腺癌与其他胰腺损伤？
图4：从已通过组织学确定的5位胰腺腺癌前体损伤(PCPL）病人、正常人和 26位良性胰腺疾病，分离其外泌体，发现PCPL组的 GPC1+crExos 显著高于正常人和良性胰腺疾病病人，并且正常人和良性胰腺疾病病人的GPC1+crExos 水平接近，表明GPC1+crExos 能够检测出早期胰腺癌。
5GPC1+crExos 是否会随着肿瘤的状态发生改变，能否动态反映胰腺癌肿瘤的变化？
图5：GPC1+crExos在远距离转移中的水平最高，转移到淋巴结的比非转移的要高。对良性胰 腺病胰腺腺癌前体损伤和胰腺胆管癌病人手术前后取血清，比较胰腺腺癌前体损伤和胰腺胆管癌病人 GPC1+crExos 的变化，发现胰腺腺癌前体损伤和胰腺胆管癌病人手术后显著低于手术前。手术后 GPC1+crExos 水平下降幅度大于平均值的病人生存率高于 GPC1+crExos 水平下降幅度小于平均值的病人。以上数据表明 GPC1+crExos 能报告肿瘤负荷。
通过对外泌体的探究，本文总结出 GPC1+crExos 诊断胰腺癌的优势：
1. 绝对的特异性和敏感性：相比常用的CA 19-9生物标志物，胰腺癌小鼠模型还未显示出MRI可以检测到胰腺疾病迹象之时，GPC1+ crExos 就检测到了胰腺癌的可能性。
2. 血液样本要求量少：不同于循环肿瘤细胞(CTCs)需要大量的新鲜血液，
3. 样本保存时间长：大约30年前保存到冷冻库的血液样本中也可以检测和分离出 GPC1+ crExos。
4. 价格低，费用少。采用 MRI 或 CT 对普通人群进行胰腺癌常规筛查，价格高昂，且有可能出现许 多假阳性结果。
读到这里，有木有觉得今天的经典再读真的物超所值！下周我们会持续介绍外泌体在肿瘤方面的应用，敬请关注！需要这篇Nature原文的小伙伴记得给我们留言哦~
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